世界首隻胚胎幹細胞「嵌合猴」誕生出生自帶兩組DNA
經過5年科研攻關，中國科學家培育出全球首隻高比例胚胎幹細胞「嵌合猴」。這隻「嵌合猴」是由食蟹猴（長尾獼猴）的兩個基因不同的胚胎的細胞培育而來。11月10日，這項由中國科學院腦科學與智慧技術卓越創新中心（神經科學研究所）研究員劉真、孫強和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院研究員Miguel A. Esteban研究小組合作完成的研究，以封面論文形式在線發表於《細胞》。
當期《細胞》封面。神經科學研究所供圖
「這是該領域長期追求的一個目標。它毫無疑問是迄今除了囓齒類動物之外，利用多能幹細胞產生嵌合體動物的最佳實證。」該論文多位審稿人如是評價。
中國科學院院士季維智評估研究是靈長類多能幹細胞多能性研究的重要突破，為幹細胞多能性研究提供了一個重要平台，也為後續利用幹細胞建立疾病猴模型，透過四倍體補償法產生幹細胞猴以及體內建構組織器官打下了重要的基礎。
闖過“兩道關”
胚胎幹細胞是生命發育早期的「種子」細胞，具有無限自我複製更新的能力和強大的誘導分化發育潛能。這使得它們在細胞治療、器官再生、類器官模型建構等方面發揮重要作用。
如何證明胚胎幹細胞具有多向分化潛能？一個「黃金標準」是將取自一個囊胚的幹細胞注射到發育中的另一個囊胚內，形成具有不同基因型的嵌合體。
「理論上，注射的胚胎幹細胞具有很強的體內發育潛能，可以為嵌合體不同器官的發育作出很大的貢獻。」論文通訊作者劉真在接受《中國科學報》採訪時說。
胚胎幹細胞的發育多能性已在囓齒類動物中得到了證明。科學家在1984年首次實現小鼠胚胎幹細胞胚胎注射形成嵌合體，於2008年成功實現大鼠胚胎幹細胞胚胎注射形成嵌合體。建構非人靈長類胚胎幹細胞嵌合體技術對生物醫學研究具有重要意義，然而相關研究一直進展緩慢。
製造嵌合體，要先把幹細胞從囊胚內取出放在體外培養，再把體外擴增培養的胚胎幹細胞重新放回囊胚生長發育。「一出一進」之間有兩大難關。
第一大難關是如何獲得具有高效發育潛能的胚胎幹細胞。為突破難關，劉真與合作者選擇發育到第7天的食蟹猴囊胚分離幹細胞，這個時期的囊胚已經分裂出約100個細胞，每個細胞都具有非常強的分化發育潛能，但尚未開始出現方向性的分化。研究人員將分離的幹細胞放在體外培養，讓其保留分裂複製特徵，但不再向下分化。
他們最後建立了食蟹猴的9個幹細胞系，並將其放置在6種不同的培養體系下對其「健康」進行把關。透過單細胞轉錄組、粒線體代謝、全基因組定序等多方面系統評估，研究人員確定了具有更高多能性、更好傳代穩定性和基因組穩定性的多個幹細胞系。
第二大難關是胚胎幹細胞注射到受體胚胎後的快速凋亡。為此，研究團隊給予選出的胚胎幹細胞標記綠色螢光蛋白，以追蹤幹細胞存活情況。經過反覆實驗、試錯，他們終於找到了既不影響胚胎正常發育，又能確保幹細胞存活的最適嵌合胚胎培養條件。
2021年初，闖過上述難關的劉真與合作者把選好的幹細胞注射到早期的猴子桑葚期胚胎（發育4~5天的胚胎）中，並將74個具有明顯嵌合的囊胚移植到40隻受體雌猴體內，最後獲得了4隻流產的胚胎和6隻出生的猴子。
這些流產的胚胎或活產的猴子是否都是嵌合體？研究人員檢測發現，只有1隻流產的胚胎和1隻活產的猴子產生了明顯的嵌合。
「所以，做出嵌合體的成功率約40%，做出活產嵌合體的成功率約20%。」論文共同通訊作者孫強對《中國科學報》說。
「雖然效率有限，但結果不算太糟。」劉真說。
這個「不算太糟」的結果就是世界上首隻高比例胚胎幹細胞嵌合猴，研究人員花了近3年才讓它成功降世。
不可能成功的成功
由於非人靈長類嵌合體培養存在巨大挑戰，2012年，美國科學家在發表於《細胞》的研究中曾認為，猴胚胎幹細胞無法產生嵌合體，挑戰了靈長類胚胎幹細胞多能性理論基礎。
不過，科學家並未放棄嘗試。昆明理工大學的科學家隨後證明猴多能幹細胞，包括始發態的多能幹細胞，能夠產生嵌合體，但嵌合率僅0.1%~4.5%。「這顯示當時所獲得的多能幹細胞與囊胚期的內細胞團或外胚層，仍有較大差異。」昆明理工大學省部共建非人靈長類生物醫學國家重點實驗室教授李天晴說。
這次，研究人員使用綠色螢光蛋白標籤、基因定序以及其他測試方法，確認了活產猴大腦、心臟、腎臟、肝臟和胃腸道中都含有幹細胞來源細胞的組織類型。在不同組織類型的貢獻從21%到92%不等，在測試的26種不同組織類型中平均為67%。相較之下，那隻流產嵌合體猴的平均貢獻比例約為20%。
「這些數據有力地證明了猴子多能幹細胞具有在體內分化成各種組織的能力。」論文共同通訊作者Miguel A. Esteban對《中國科學報》說，「這項研究加深了對靈長類動物多能幹細胞發育潛力的理解。”
研究人員將取自雌性猴子胚囊的幹細胞放入雄性胚胎後，發現儘管最終形成的存活嵌合體是雄性，但其血液細胞、皮膚細胞中檢測出部分雌性基因。
“這很有趣。”孫強說，“它證明了乾細胞的分化潛力，也再次證明了胚胎幹細胞確實貢獻到了嵌合體猴。”
此外，研究團隊在兩隻嵌合體的胎盤組織中都發現了高比例的胚胎幹細胞貢獻。考慮到先前小鼠胚胎幹細胞幾乎不會貢獻到胎盤組織，顯示靈長類胚胎幹細胞可能具有獨特的發育全能性。他們在兩隻嵌合體猴的生殖細胞中也發現了胚胎幹細胞的高比例貢獻，這為建構遺傳修飾模型猴子奠定了技術基礎。
「利用靈長類多能幹細胞生產嵌合體是這一領域長期追求的目標。原則上，這項研究將為相關基礎研究和非人類靈長類遺傳修飾模型的產生開闢新途徑。具體來說，利用胚胎幹細胞實現基因修飾能力，將使完成目前在受精卵或胚胎階段使用CRISPR技術難以實現的研究成為可能。」一位審查者如是評估。
在「無人區」冒險
身為中國本土科學家，劉真從研究生到博士後一直在神經科學研究所工作。他是一名敢於在「無人區」冒險的科學家。
食蟹獼猴或長尾獼猴（Macaca fascicularis）是一種被廣泛用於科學研究的物種，但它仍然引發了許多倫理問題
克隆猴是一直以來沒被解決的問題，甚至曾被斷言不可能解決。2018年，仍在從事博士後研究的劉真作為第一作者和導師孫強以封面文章形式在《細胞》發表體細胞克隆猴“中中”“華華”。這項科學研究成果讓全球科學界矚目。
此外，劉真作為第一作者建立的自閉症非人靈長類模型、世界首例生物節律紊亂體細胞克隆猴模型先後發表於《自然》《國家科學評論》等期刊。今年4月，他作為通訊作者和團隊在《細胞-幹細胞》發表的體外重建非人靈長類類囊胚研究，首次將非人靈長類的類囊胚體外培養至著床後原腸胚時期。英國牛津大學幹細胞生物學家Alejandro De Los Angeles評論稱：“這些發現是乾細胞類胚胎模型領域的一個里程碑。”
“做科研一定要敢於冒險。”劉真說，“就像研究生入學時，蒲慕明院士講的那樣，要敢於啃’硬骨頭’。”
「我們的目標不只是一步領先，而是要步步領先。」劉真說。
生命科學前沿的路並不好走。除了科學研究方面的難題，每次，劉真與合作者們介紹研究成果時，必然會被「拷問」相關倫理問題。例如嵌合體研究是否會帶來像希臘神話中「奇美拉」一樣的怪物。
對此，劉真表示，相關研究都遵循了國際國內相關程序，確保遠離紅線。
「目前，我們所進行的只是基礎科學研究。相關研究未來對基因工程技術發展和瀕危物種保育有實際意義，可以幫助我們建構更精確的猴子模型，用於神經系統疾病以及其他生物醫學領域的研究。 」他說，例如建立「漸凍症」動物模型，推動相關疾病治療。
下一步，研究人員希望提升嵌合體猴的培育效率，並進一步探索限制嵌合體猴存活的因素。
據介紹，首隻胚胎幹細胞系「嵌合猴」僅存活了10天，其背後的原因目前研究團隊尚不清楚。他們只發現嵌合體中由胚胎幹細胞發育而來的細胞和受體胚胎細胞發育而來的細胞在表觀遺傳修飾上有一些差異。
「所以，我們要繼續尋找原因。」劉真說。