科學家詳細研究了已知最小的CRISPR-Cas13系統之一CRISPR-Cas13bt3的三維結構，該系統用於RNA修飾，其運作方式與同家族的其他蛋白質不同。這項發現使他們能夠提高工具的精確度，更好地進入並傳遞到目標編輯位點，從而有望透過靶向RNA 更有效地對抗病毒。

萊斯大學的科學家們詳細描述了用於切碎或修改RNA 的已知最小CRISPR-Cas13 系統之一的三維結構，並利用他們的發現進一步改造了這一工具，以提高其精確度。根據發表在《自然-通訊》（Nature Communications）上的一項研究，該分子的工作原理與同家族的其他蛋白質不同。

“CRISPR系統有不同的類型，我們這次研究的重點是一種稱為CRISPR-Cas13bt3的系統，”幫助領導這項研究的德克薩斯州癌症預防與研究所學者、生物科學助理教授高揚說。「它的獨特之處在於體積非常小。通常，這類分子包含大約1200 個氨基酸，而這個分子只有大約700 個，所以這已經是一個優勢了。”

Emmanuel Osikpa（左起）與鄧翔宇

體積小是一個優點，因為它可以更好地進入和傳遞到目標編輯位點。與Cas9蛋白相關的CRISPR系統不同–Cas9蛋白通常以DNA為標靶–Cas13相關係統以RNA為靶標，RNA是將DNA編碼的遺傳訊息轉化為組裝蛋白質藍圖的中間”說明書”。

研究人員希望這些RNA 標靶系統能用於對抗病毒，因為病毒通常使用RNA 而不是DNA 來編碼其遺傳訊息。

“我的實驗室是一個結構生物學實驗室，”高揚說。”我們試圖了解這個系統是如何運作的。因此，我們的部分目標是能夠在三維空間中看到它，並創建一個模型，幫助我們解釋其機制。”

用冷凍電子顯微鏡製作的最小CRISPR-Cas13bt3 分子模型。要辨識和切割的RNA 以淺藍色表示，而剪刀則由洋紅色和青色的結構域組成。控制CRISPR-Cas13bt3 的兩個環分別以綠色和紅色表示。圖片來源：高揚實驗室/萊斯大學提供

研究人員使用低溫電子顯微鏡繪製了CRISPR系統的結構圖，將分子放在一層薄冰上，然後發射一束電子穿過它，產生數據，然後將數據處理成詳細的三維模型。結果令他們大吃一驚。

“我們發現這個系統部署了一種不同於Cas13 家族其他蛋白質的機制，這個家族中的其他蛋白質有兩個最初分開的結構域，在系統被激活後，它們會合到一起–有點像剪刀的兩臂–然後進行剪切。這個系統則完全不同：剪刀已經存在，但它需要在正確的目標位點鉤住RNA 鏈。為此，它在這兩個獨特的環上使用了一個結合元件，將蛋白質的不同部分連接在一起”。

Emmanuel Osikpa（左起）、Xue Sherry Gao、Xiangyu Deng、Jamie Smith、Seye J. Oladeji 和Yang Gao。圖片來源：Jeff Fitlow 攝影/萊斯大學

高揚實驗室的博士後助理研究員鄧翔宇說，”確定蛋白質和RNA複合物的結構確實很有挑戰性，我們必須做大量的故障排除工作，使蛋白質和RNA 複合物更加穩定，這樣我們才能繪製出它的結構圖。”

研究團隊弄清楚了該系統的工作原理，化學和生物分子工程師高雪莉實驗室的研究人員就開始對該系統進行調整，以便透過在活細胞中測試其活性和特異性來提高其精確度。

「我們發現，在細胞培養過程中，這些系統能夠更容易地鎖定目標，」化學與生物分子工程學泰德-N-勞（Ted N. Law）助理教授高雪莉（Sherry Gao）說。”這項工作真正難能可貴的地方在於，詳細的結構生物學洞察力使我們能夠合理地確定提高工具特異性所需的工程努力，同時仍能保持較高的靶標RNA 編輯活性。”

鄧翔宇圖片來源：Jeff Fitlow/萊斯大學

薛高實驗室的研究助理埃馬紐埃爾-奧西帕（Emmanuel Osikpa）進行了細胞實驗，證實了工程化的Cas13bt3能夠高保真地靶向指定的RNA基團。

Osikpa說：”我能夠證明，這種工程化的Cas13bt3比原始系統的性能更好。對結構的全面研究凸顯了有針對性的、以結構為導向的方法比大規模、高成本的隨機突變篩選更有優勢。”