目前關於新冠病毒（SARS-CoV-2）的基因組調查數據表明，病毒存在著大量的單核苷酸變異(SNVs)，此前尚無研究表明突變與病毒致病性的功能改變直接相關。然而，李蘭娟院士團隊的最新研究提出了直接證據，證明目前發生在新冠病毒基因組中的突變具有影響病毒致病性的功能潛力。

（原標題：李蘭娟團隊：新冠突變影響致病性，體外感染顯示270倍差異）

澎湃新聞記者賀梨萍

李蘭娟團隊提示：疫苗和藥物的開發需要考慮到這些累積突變，尤其是始祖突變的影響，以避免潛在的缺陷。

在最新的一份研究中，來自浙江大學的研究團隊報告了11例新冠患者來源的病毒分離株的功能特徵，它們都至少有一個突變。重要的是，當感染Vero-E6細胞時，這些病毒分離株在細胞病變效應和病毒載量方面表現出顯著差異，差異高達270倍。

當地時間4月19日，浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室、浙江大學生命科學研究院、浙江省胰腺病研究重點實驗室的研究團隊在醫學預印本平台medRxiv在線發表了一篇研究論文“Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2”。該論文通訊作者為中國工程院院士、國家衛健委高級別專家組成員李蘭娟教授，浙江大學生命科學研究院研究員蔣超，浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室吳南屏教授和鄭敏教授。

目前的研究認為，跨膜刺突糖蛋白（S蛋白）介導病毒進入宿主細胞，S蛋白根據蛋白結構功能又被分為兩個功能單位，即S1和S2蛋白亞基。其中S1負責與宿主細胞受體結合，S2負責病毒和細胞膜融合。新冠病毒和SARS-CoV都使用血管緊張素轉換酶2（ACE2）進入靶細胞。ACE2在人鼻上皮細胞和肺、精原細胞、間質細胞、支持細胞、胃、十二指腸和直腸上皮細胞中表達。

論文提到，S蛋白的受體結合域（RBD）是β冠狀病毒中最具變異性的基因組部分，S蛋白的某些位點可能會受到正向選擇。不過，儘管新冠病毒具有大量的變異性，一個關鍵的問題仍然是：這些突變是否對新冠病毒的致病性有任何真正的功能影響？

研究人員認為，上述問題對理解病毒感染機制至關重要，並指導藥物和疫苗的開發戰略，為應對疫情大流行下一階段做準備。為了解決這一問題，研究人員從浙江大學附屬第一醫院收治的患者中分離出11株新冠病毒毒株。

研究人員在Novaseq 6000平台上對11株病毒分離株進行超深度測序，發現病毒分離株的編碼序列分別存在1-5個突變，同樣也觀察到混合群體（代表病毒準種，Quasi-species）。他們總共鑑定出33個突變（包括在混合群體中觀察到的10個突變），根據與GISAID在2020年3月24日提供的1111個基因組序列的比較，其中19個是新的突變。

研究人員還用11株病毒分離株感染了Vero-E6細胞，並定量評估了它們在感染後（PI）1、2、4、8、24和48小時的病毒載量，以及在感染後48和72小時的病毒性細胞病理效應（CPE）。

他們的研究結果表明，在感染Vero-E6細胞時，觀察到的突變會對病毒載量和細胞病理效應產生直接影響，差異最高達270倍。這一發現表明，研究中觀察到的病毒突變，可以顯著影響新冠病毒的致病性，而這種突變在全球各地採集的病毒毒株中都可能存在。

總體而言，這項研究提供了直接證據，證明目前發生在新冠病毒基因組中的突變具有影響病毒致病性的功能潛力。研究人員提醒，除了不斷積累的基因組測序數據外，還應盡可能在細胞水平上進行病毒監測。最後，與流感類似，藥物和疫苗的開發雖然緊迫，但也需要考慮到這些累積突變，尤其是始祖突變的影響，以避免潛在的缺陷。

患者流行病學病史

本研究中涉及的11例患者的樣本收集於國內疫情暴發的早期階段，時間為2020年1月22日至2020年2月4日。

11例患者中有10例與武漢有明確關係，這11人中有5人確診前在武漢工作或旅行，另外5人與居住在武漢的人有過密切接觸，剩下的1人與新冠患者有過接觸。值得注意的是，患者ZJU-4、ZJU-5、ZJU-9均參加了有武漢同事出席的同一個商務會議。

因此，根據這11例患者的流行病學歷史，他們構成了第一代和第二代感染病例。

11例患者中男性8例，女性3例，年齡4個月至71歲不等。除1例患者外，其餘所有患者均有中度或更嚴重的症狀，3例有合併症，1例需要ICU治療。

截至該論文撰寫，所有病人均已康復。

11例患者中採集的病毒分離株中存在多種突變

為了評估這11株病毒分離株的突變譜，研究人員在Illumina Novaseq 6000平台上對分離的病毒基因組RNA進行了超深度測序，平均每個樣本產生2.45億個讀數/67.16 Gb。

他們總共鑑定出33個突變（包括在混合群體中觀察到的10個突變），根據與GISAID在2020年3月24日提供的1111個基因組序列的比較，其中19個是新的突變。

具體來說，在ZJU-1中發現了G11083T和G26144T，這兩種突變都被認為是一個大群體病毒的始祖突變。ZJU-2和ZJU-8中發現了C8782T和T28144C突變，這兩種突變被認為是另外一個大群體病毒分離株的始祖突變。

ZJU-2、ZJU-5、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11這5個病毒分離株中均發現了T22303G突變，ZJU-5和ZJU-9在一次商業會議中暴露於相同的潛在感染源。值得一提的是，此前僅在澳大利亞分離得到的病毒株中鑑定出具有T22303G突變。

值得注意的是，和ZJU-5、ZJU-9參加同一會議的患者ZJU-4的病毒分離株有一個新的突變A22301C，它在蛋白水平上（S蛋白中的S247R）導致了與T22303G相同的錯義突變。

最後，ZJU-11在ORF7b基因中有4個突變，其中3個是連續的，並在蛋白水平上引入了2個突變。

值得注意的是，研究人員認為，儘管GISAID中的序列數據對跟踪病毒的個體間變異非常有幫助，但我們仍然對病毒的個體內進化動力學知之甚少。例如，在ZJU-4和ZJU-10中，兩個獨立位點的等位基因頻率分佈非常相似，這表明這兩個位點可能是相關聯的，提示在病毒種群中至少存在兩種單倍型。

總的來說，儘管在這項研究中只分析了11株來自病人的病毒株，研究人員仍觀察到突變多樣性，包括目前在全球傳播的不同主要病毒簇的幾種基本突變。這種多樣性的突變譜與它們相對較早的採樣時間和相對接近武漢市是一致的。不過，由於樣本量有限，武漢地區早期病毒的完全變異多樣性至今仍不清楚。

研究人員討論指出，在11個病毒分離株中發現了多種突變，包括目前感染全球人口的兩大類病毒的兩組始祖突變。此外，儘管取樣日期相對較早，31個已鑑定的突變中有19個是新的，這表明病毒株的真正多樣性在很大程度上仍未得到充分認識。

另外，T22303G突變在5個病毒株中均觀察到，這個特定的突變在早期疫情中已經出現，並可能在相當數量的武漢人身上都有。這可能是由於突變的始祖效應，在這種效應情況下，T22303G突變在早期並沒有從中國傳播出去。

值得注意的是，ZJU-11的三核苷酸突變是出人意料的。研究人員注意到，這個特殊的病毒分離株在研究中的病毒載量和CPE測定中都顯得非常“強有力”，其來源病人也非常罕見地持續45天新冠陽性，最近從醫院出院。

他們認為，研究這種三核苷酸突變的功能影響將是非常有趣的。值得注意的是，在目前的數據庫中，另一個三核苷酸突變（G28881A, G2882A和G28883C）已被鑑定出，也導致了兩個蛋白水平的錯義突變。

研究人員還提醒一點，與最近報導的不能從糞便樣本中獲得活病毒相反，這項研究中有3個病毒分離株是從糞便樣本中提取的，研究表明新冠病毒能夠在糞便樣本中可以復制。

系統發育分析揭示不同的進化史

為了從已有的新冠病毒測序數據中了解11株病毒分離株的系統發育背景，研究人員從GISAID（下載於2020年3月21日）獲得了725個高質量、高覆蓋的新冠病毒基因組，其中包括2013年在雲南中華菊頭蝠中採集的RaTG13病毒株和廣東穿山甲病毒株作為外群。

研究人員構建了一個包含736個病毒序列的最大似然系統發育樹，得到的系統發育樹與GISAID上更新的系統發育分析基本一致。

研究觀察到相當多的始祖突變。具體來說，在這項系統發育分析中，研究人員注意到以下三個最大的簇：第一、在231個病毒序列中發現三個核苷酸突變C241T、C14408T和A23403G（S-D614G簇） ，大部分在歐洲分離獲得；第二、在208個病毒序列中發現兩個核苷酸突變C8782T和T28144C（ORF8-L84S簇），在這項分析中它們不是單源的(圖2A和圖S3 )。然而，在ORF8-L84S簇內的92個基因組序列上可以觀察到明顯的單源亞支（subclade），主要由來自美國西雅圖的病毒序列組成（ORF8-L84S-USA-WA-clade）；第三、在34個病毒序列中發現兩個核苷酸突變G11083T (ORF1a中的L3606F)和G26144T (ORF3a中的G251V)，其中大部分來自荷蘭和英國。

研究人員提到，還可以觀察到幾個由不同的始祖突變集定義的較小的單源簇。例如：第一、31個病毒序列發現了G1937A (ORF1a中的V378I)突變；第二、12個病毒序列中發現了G1440A和G2891A突變，導致了ORF1a基因的G392D和A876T突變，大部分來自德國或荷蘭；第三、8個基因組序列中發現了C15325T和C29303T突變，導致了N基因的P344S突變，來自中國或日本。

研究人員將11株病毒分離株整合到系統發育分析中，它們分散在整個系統發育空間中。ZJU-1與ORF1a-L3606F和ORF3a-G251V組聚類，它同時具有這兩種典型的突變。另一方面，ZJU-2與ZJU-8和ORF8-L84S聚類，它們都有兩個始祖突變。由於上述T22303G突變，ZJU-9和ZJU-11與澳大利亞的一個分離株聚類。其他毒株則或者突變較少，或者沒有與任何已知的大規模群體聚集的新突變，這反映了這11個樣本的廣泛多樣性。

綜上所述，研究人員認為，一些單源病毒群確實表現出明顯的地理模式（特別是歐洲和美國），但這可能是由於在大流行初期發生各自突變的“始祖效應”。

感染Vero-E6細胞時，病毒拷貝數和細胞病理效應有顯著差異

目前來看， COVID-19患者表現出多種臨床症狀，流行病學研究表明，臨床結果受個體年齡、並發症和其他潛在未知參數的嚴重影響。為了檢測患者來源的新冠病毒分離株的突變影響，研究人員進行了體外感染試驗。

研究人員首先檢測了病毒分離株是否能如預期那樣成功地與Vero-E6細胞結合，並以S蛋白形成的標誌性“皇冠”來直觀識別病毒顆粒。然後，他們用所有11個病人來源的病毒分離株感染Vero-E6細胞，並在感染後1、2、4、8、24和48小時收集細胞。在48小時和72小時時分別取細胞的DIC顯微照片來評估CPE。

他們使用針對ORF1a、E和N基因的特異性實時轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)來檢測新冠病毒的存在。循環閾值Ct用於量化病毒載量，較低的值表示較高的病毒載量。由於這三個基因的結果高度一致，他們只討論ORF1a基因的結果。

簡要來說，所有病毒分離株樣本感染後1、2、4小時的Ct值保持平穩，僅有小的波動。在這些較早的時間點上，病毒粒子結合入侵細胞，病毒複製在這個階段很少發生。

在感染後8小時，研究人員觀察到ZJU-6、ZJU-7、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11的Ct值顯著下降，即意味著病毒載量增加。感染後24小時，觀察到除了ZJU-2和ZJU-7外，所有病毒分離株的Ct值都顯著下降，其中一些病毒分離株，即ZJU-10和ZJU-11，下降速度比其他病毒快得多。感染後48小時，除ZJU-10和ZJU-11外，所有病毒分離株均有小幅度下降，研究人員推測ZJU-10和ZJU-11在24小時時均已趨於穩定。

值得注意的是，感染後24小時，ORF-8-L84S簇成員ZJU-2和ZJU-8（大部分來自美國華盛頓州西雅圖）的病毒載量顯著降低。另一方面，與S-D614G分支(主要在歐洲發現)同簇的ZJU-1病毒載量是ZJU-2和ZJU-8的19倍。此外，在感染後24小時，ZJU-10和ZJU-2的病毒載量相差近270倍。

論文提到，這些差異在48小時變得有統計學意義，在分析基因E和N的數據時是可重複的。因此，研究人員認為，不同的病毒分離株在感染Vero-E6細胞時表現出顯著的病毒載量變化，這是由其基因組的不同突變決定的。

接下來，研究人員檢驗了病毒載量增加是否會導致更多細胞死亡。在感染後48小時和72小時顯微鏡下觀察這些細胞系，CPE或細胞死亡率與病毒載量數據高度一致，表明病毒載量越高，細胞死亡率越高。

他們在討論環節提到，由於患者表現出的臨床症狀極為多樣，在患者中建立基因型與表型的聯繫將是非常困難的。體外細胞系提供了一個理想的系統，以檢查不同的分離病毒株突變的影響。

他們認為，雖然Vero-E6細胞係並非來源於人，但Vero-E6細胞系的ACE2蛋白與人的ACE2蛋白高度相似，直接證明了新冠病毒可以感染該細胞系。