螢光顯微鏡具有獨特的能力來觀察細胞的過程，跨越了四個數量級的尺度。 然而，它在活細胞上的應用基本上受到了定義其生存狀態的分子的快速和不斷運動的限制。 更重要的是，光與螢光探針的相互作用導致了分子過程的破壞。

位於多特蒙德的馬克斯·普朗克分子生理學研究所的系統細胞生物學部門開發了在顯微鏡下進行活體觀察的細胞超快速冷凍凍結技術，現在它繞過了這些基本問題。 該方法的核心是以每秒20萬攝氏度的速度將活細胞冷卻至-196攝氏度。 這使得細胞生物分子在捕獲時能夠以其自然排列的方式得到前所未有的保存。 在這種低溫狀態下，分子的運動和光誘導的破壞被停止，使我們能夠觀察到原本看不見的生命分子模式。

我們身體上的近100萬億個細胞之所以活著，是因為它們通過持續的能量消耗使自己保持在一個永久的活躍狀態。 因此，構成細胞的微觀模式源於數十億納米大小的生物分子的不斷動態行為，比如蛋白質、脂質、核酸和其他分子，它們以看似雜亂無章的方式四處奔忙。

為了觀察更高規模的組織是如何從這種持續的活動中產生的，生物分子物種可以有選擇地配備螢光探針。 這些螢光分子是光子催化劑：它們吸收高能量的光子（例如藍光），然後發射低能量的光子（紅移）。 這些光子可以通過顯微鏡成像，不僅可以精確定位標記的生物分子，還可以報告局部的分子反應。 然而，光對探針的破壞和至關重要的分子運動的模糊是兩個基本問題，它們阻礙了在細胞尺度上觀察生命的分子過程如何產生結構。

螢光顯微鏡的不確定原理

螢光顯微鏡能在多大程度上分辨出一個特定的結構或分子，這基本上取決於從這個結構中收集到的光的量。 這類似於試圖在夜空中看到星星。 只有那些比周圍更亮的恆星才會被第一眼看到。 如果我們用長時間曝光來拍攝夜空，就會看到更多的星星，但會由於地球自轉而變得模糊。

同樣，在螢光顯微鏡下曝光時間可以延長，以增加檢測光的數量。 然而，微觀結構從不靜止不動，而是表現出隨機和定向運動。 延長曝光時間從而導致結構的模糊。 然而，在這種情況下，小結構的運動比螢光團的光子催化要快得多，因此精度不能通過創造更好的探測器或更強的照明來提高。 甚至，光子催化過程會產生有毒的自由基，這些自由基不僅破壞分子過程，最終殺死細胞，還會破壞螢光分子本身。 這最終限制了從活細胞內的探針中可以收集到的光量。

這個解決方案真的很酷

Jan Huebinger在Philippe Bastiaens的團隊中開發了一種技術，可以在螢光顯微鏡下直接觀察活細胞中任何時間點的分子活動模式，時間間隔為毫秒。 通過這種方法，運動模糊和光破壞的基本問題可以同時被避免。

這種阻止是通過極快地冷卻到非常冷的溫度（-196°C）來完成的，以至於分子運動實際上停止了。 逮捕行動必須非常迅速，原因有二：首先，如果捕捉太慢，定義活細胞的激活顯微鏡模式就會分解成死亡狀態。

第二，凍結的速度必須比冰的形成過程快，因為冰的形成會破壞細胞。 這也可以在更大的範圍內觀察到，例如，西紅柿在冷凍后變糊狀。 在0°C到-136°C的臨界範圍內，冰的形成非常快。 然而，非直觀的是，在非常低的溫度下（低於-136°C），冰晶實際上不會再形成，因為水分子的運動實際上也停止了。 這就意味著，冷卻速度必須超過每秒10萬攝氏度。

研究人員已經掌握了這一技術挑戰，他們開發了一種與顯微鏡集成的超快速冷卻裝置，其中液氮（-196°C）的冷卻在高壓下加速到鑽石上。 同一顆鑽石的另一面還保存著含有細胞的樣本。 高壓爆破加上金剛石特殊的熱導率，可以實現必要的高冷卻速率，使細胞在-196°C的自然狀態下停止運行。 這不僅解決了運動模糊的問題，而且阻止了光化學破壞。 這打開了幾乎無限暴露的可能性，這些新的分子模式之前在噪音中會被模糊。

使不可見變為可見

超快速冷凍阻止允許使用通常具有破壞性的高鐳射功率，以數十納米的解析度分析天然分子模式，而這些解析度本來是看不見的。 更重要的是，由於在-196°C下沒有光破壞，相同的阻滯細胞可以通過不同的顯微鏡模式進行觀察，以測量從分子到細胞尺度的模式。

這項新技術由此導致發現了一種癌蛋白和一種腫瘤抑制蛋白的納米級共組織，從而保護細胞不表現出惡性行為。 “這是螢光顯微鏡的一個有利步驟，特別是超解析度顯微鏡和顯微分光鏡的結合，允許在多個尺度上繪製細胞中的分子反應。 這將改變我們觀察細胞中分子組織和反應模式的方式，從而提供更多關於自身或細胞自組織能力的洞察力，”Philippe Bastiaens說。