西湖大學施一公教授研究組在《科學》（Science）發表題為《激活狀態的人源次要剪接體的結構》（Structure of the Activated Human Minor Spliceosome）的科研論文，是剪接體結構與機理研究的又一個重大突破。

在這篇論文中，他們首次報導了迄今整體研究知之甚少的次要剪接體的高分辨率三維結構，展示了在剪接反應中的一個關鍵構象——激活態次要​​剪接體（activated minor spliceosome ，定義為“次要Bact複合物”），整體分辨率高達2.9埃。該結構第一次展示了人源次要剪接體的組成、以及對稀有內含子（U12依賴型內含子）的識別機理，首次揭示了次要剪接體的催化中心以及活性位點，並且通過結構解析鑑定了次要剪接體的全新蛋白組分、揭示了它們對次要剪接體及罕見內含子剪接的重要作用等一系列重要科學問題。

此次重大突破，使施一公研究組在繼2015年首次解析世界上第一個剪接體結構、2017年解析第一個人源剪接體結構之後，再次成為世界上首個解析了次要剪接體高分辨率三維結構的團隊。

圖1 施一公研究組最新《科學》長文

在高等生物中，一段又一段的遺傳密碼埋在核酸分子中。其中，“無效”的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內含子，而可以被核醣體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子。把這些遺傳密碼中“無效”的內含子“剪”出來，“有效”的外顯子“接”到一起的過程叫做RNA剪接，它是生命體解讀遺傳密碼的核心步驟。負責執行這一步驟的就是細胞核內復雜精密的分子機器——剪接體。每個細胞對於每一條剪接前的基因信使——前體信使RNA的剪接在時空上是非常精準的。剪掉誰，剪掉多長，什麼時候剪，按照什麼順序把外顯子拼接起來，每一個“操作”都是可能改變細胞命運的關鍵問題。一步走錯，結果千差萬別，基因的表達和傳遞也會因此出現錯誤，於是就導致了人類某些先天遺傳疾病以及後天疑難雜症的出現。研究發現，人類的遺傳疾病大約有35%都是因為剪接異常造成的。從1977年首次發現RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉澱、基因敲除、交聯質譜、建立體外剪接反應系統等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調控等複雜的RNA剪接調控網絡。

20世紀90年代，科學家在對高等真核生物內含子序列的研究分析中，發現了一類非經典的內含子剪接序列（5’剪接位點為AT，3’剪接位點為AC） ，一種全新的剪接體開始逐漸進入科學家的視野。在隨後的研究中，科學家們逐漸確定了這個全新剪接體的核酸組成，其中U11、U12、U4atac、U6atac四種新的snRNA參與該類內含子的識別與剪接。由於這種非經典的內含子佔比不足百分之一，該類內含子被稱作稀有內含子，而因其特殊的剪接位點及識別該位點的特殊snRNA組分，該類內含子又被命名為AT-AC內含子（AT-AC intron）或U12依賴型內含子（U12-type intron），催化該類內含子剪接的這種全新剪接體被命名為次要剪接體（minor spliceosome）。儘管由次要剪接體進行剪接的稀有內含子含量極低，但是這些基因卻與許多重要的細胞基本生命活動密切相關，比如DNA的複制與修復、RNA轉錄與翻譯等等。然而，對於U12依賴型內含子以及次要剪接體的研究卻發展緩慢，次要剪接體的蛋白組成、重塑調控等等關鍵的科學問題，一直沒有答案。其中非常重要的一步——如何捕獲並純化次要剪接體，是領域內面臨的一個巨大難題。

施一公研究組一直致力於剪接體的三維結構與RNA剪接分子機理的研究，自2015年報導了第一個剪接體的高分辨率三維結構後，相繼解析了釀酒酵母和人源主要剪接體（major spliceosome）的全部已被鑑定的基本構象。這些已解析的剪接體覆蓋了整個RNA剪接循環，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應的工作機理，同時為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發生提供結構依據，首次將剪接體介導的RNA剪接過程完整的串聯起來，為理解RNA剪接的分子機理提供了最清晰、最全面的結構信息（圖2）。與此同時，施一公研究組也將目光聚焦在了研究更為匱乏的次要剪接體研究領域。

圖2施一公研究組解析的剪接體結構匯總（圖片來源： Wan et.al， 2020，  Annu Rev Biochem）

在沒有任何次要剪接體的捕獲與純化等相關文獻的情況下，摸索並建立次要剪接體的捕獲與純化方法迫在眉睫。施一公研究組的白蕊博士與萬蕊雪博士，長期從事剪接體的純化與結構研究工作，並積累了大量剪接體結構研究的經驗。在此研究經驗基礎之上，結合次要剪接體識別位點的特異性，研究組首次設計出一條全新的U12依賴型的pre-mRNA。通過改良前人的體外剪接反應實驗條件，成功地確定了該U12依賴型的pre-mRNA具有極高的特異性與剪接的高效性。由於次要剪接體的含量極低，如何進一步獲得性質良好的次要剪接體樣品，成為本文研究的第二大難點。白蕊和萬蕊雪在原有的剪接體純化基礎之上，進一步探索與改良，最終首次建立起一套完整的次要剪接體捕獲與純化方法，成功獲得了處於激活態的次要剪接體的蛋白樣品，隨後利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了世界上首個次要剪接體的冷凍電鏡結構，整體分辨率為2.9埃，並搭建了第一個次要剪接體的原子模型，其中包含了4條RNA和45個蛋白（圖3）。

圖3 人源次要剪接體的三維結構

該文解析的人源次要剪接體Bact complex結構，首次觀察到了次要剪接體特有組分U6atac snRNA和U12 snRNA的三維結構，揭示了識別U12-type內含子剪接位點的結構基礎，第一次展示了次要剪接體活性位點和催化中心的三維結構。在次要剪接體的活性位點中，兩個具有關鍵作用的催化鎂離子被周圍的RNA配位結合，為剪接反應的發生提供了基礎。該結構的成功解析，首次鑑定出了5個全新的蛋白組分，它們參與組成次要剪接體因此在U12依賴型內含子的剪接中起重要作用。SCNM1、CRIPT為U12 snRNP的特有組分，參與識別和穩定內含子上的剪接位點；RBM48與ARMC7形成複合物，結合在U6atac snRNA的5’末端，結合併保護U6atac snRNA特有的γ-甲基磷酸帽結構，起到穩定U6atac snRNA構象的作用。此外，參與泛素化通路的PPIL2蛋白在剪接體中的結構首次解析，該蛋白深入次要剪接體的活性位點，與U5 snRNA有直接的相互作用，參與穩定U5 snRNP以及次要剪接體的催化中心。值得一提的是，在主要剪接體激活過程中起關鍵作用的“動力驅動”蛋白Prp2及其激活因子Spp2，也以類似的方式結合到次要剪接體中，這是Prp2同時也在次要剪接體中起作用的第一個支持性證據。由此不難推斷，推動主要剪接體進行結構重塑的數個ATPase也參與次要剪接體不同構象之間的轉變與重塑中，即次要剪接體與主要剪接體之間共享結構重塑蛋白因子（圖4）。該文作為第一篇揭示人源次要剪接體的結構研究，文中建立的捕獲與純化次要剪接體的方法、鑑定的參與次要剪接體的組成的全新蛋白等，都將對U12依賴型的RNA剪接分子機理的研究產生重要影響。

圖4 次要剪接體與主要剪接體的結構差異

西湖大學生命科學學院施一公教授、西湖大學生命科學學院西湖學者萬蕊雪博士為本文的共同通訊作者；西湖大學生命科學學院博士後白蕊和西湖學者萬蕊雪為本文的共同第一作者；清華大學生命學院博士後王琳參與了部分生化研究；清華大學生命學院博士生徐魁、清華大學生命學院張強鋒研究員為結構模型的搭建提供了幫助；清華大學冷凍電鏡平台主管雷建林博士為冷凍電鏡數據收集提供了幫助。電鏡數據採集於清華大學冷凍電鏡平台，計算工作得到清華大學高性能計算平台、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的支持。本項研究成果來自於西湖實驗室，獲得了西湖教育基金會、北京結構生物學高精尖創新中心（清華）及國家自然科學基金委的經費支持。